支原體快速檢測試劑盒（細(xì)胞培養(yǎng)）

《Quick Cell快速支原體檢測試劑盒》主要用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清或別的液體樣品（如血清）中是否含有支原體污染，該試劑盒僅用于基礎(chǔ)科研。

哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細(xì)胞的所有參數(shù)，導(dǎo)致實驗結(jié)果的不準(zhǔn)確、甚至*錯誤。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細(xì)胞培養(yǎng)都要進(jìn)行支原體檢測。本試劑盒可以檢測：（1）M.Hyorhinis、（2）M.Fermentans、（3）M.Arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）Acholeplasma Laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis等幾乎所有常見的污染細(xì)胞的支原體（注：M.為Mycoplasma的縮寫）。以上13種支原體約占細(xì)胞支原體污染的99%以上，本試劑盒產(chǎn)品全部可以檢測。絕大多數(shù)支原體污染集中于前8種。注意：本試劑盒無法檢測Ureaplasma Urealyticum支原體！Ureaplasma Urealyticum在支原體污染種極其罕見。

與PCR法檢測支原體比較，本試劑盒產(chǎn)品優(yōu)勢優(yōu)勢顯著：

試劑盒組成

（1）溶液Ⅰ：1150 μL （50次檢測）

（2）溶液Ⅱ：50 μL（50次檢測）

（3）溶液Ⅲ：指示劑，50 μL（50次檢測）

（4）陽性支原體DNA：50 μL

（5）礦物油：1500 μL

使用方法

1. 待測樣品的準(zhǔn)備：為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，待測的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品來源于至少培養(yǎng)三天且匯合度在70-90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)上清（貼壁細(xì)胞），無需離心。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后，至少讓細(xì)胞生長3天再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，也無需離心。哺乳動物細(xì)胞的存在不會影響檢測結(jié)果。

注：收集的待測細(xì)胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個月，在-80℃可以長期保存。此外，為了節(jié)約檢測成本，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。

2. 反應(yīng)體系的配制

表1：恒溫反應(yīng)體系的配制

（1）將溶液Ⅰ、溶液Ⅲ從-20℃冰箱中取出，待其融化后（可在37 ℃ 水浴內(nèi)放置5-10分鐘以幫助融化），從-20℃冰箱中取出溶液Ⅱ置于冰上。吹吸均勻后，按表1比例，混合溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ。如有多個樣品，為了防止移液誤差，建議溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ用量乘以系數(shù)1.08，保證每個反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量。從配液開始的所有步驟，均在冰上操作。

舉例：如果待測樣品為3個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數(shù)為5個。溶液Ⅰ的總體積為23×5×1.08=124.2μL，溶液Ⅱ的總體積為1×5×1.08=5.4μL，溶液Ⅲ的總體積為0.18×5×1.08=0.972 μL將溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合均勻。

注：溶液Ⅱ必須一直在-20 ℃冰箱中保存，并在操作時置于冰上。溶液Ⅱ即使在-20 ℃條件下仍為液態(tài)，不需置于室溫。

（2）將上述配制好的反應(yīng)體系，吹打均勻后，按每管24 μL分裝到0.2 mL的PCR管中。盡量保證每管的反應(yīng)液體積一樣。 PCR管應(yīng)該使用透明度良好的薄壁PCR管。

（3）往測試管（Test）中加入1μL待測細(xì)胞培養(yǎng)液；往陽性對照管（Positive）中加入1 μL陽性支原體DNA；往陰性對照管（Negative）中加入1μL滅菌水；反應(yīng)液的總體積為25 μL。

注1：裝有陽性支原體DNA的螺口管開蓋之前，用力甩一下，或者用迷你離心機(jī)即可。

注2：進(jìn)行反應(yīng)體系配制的房間，與進(jìn)行樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間分開。

3. 反應(yīng)

PCR儀設(shè)置程序：61℃，60 min；10℃, forever；熱蓋溫度，100 ℃。

注意：若實驗室反應(yīng)場所沒有PCR儀，可用水浴鍋代替，水浴鍋顯示溫度與實際溫度的溫差不超過0.5℃，另須往每個反應(yīng)管內(nèi)加入25μL礦物油，以防止水份揮發(fā)，然后蓋上蓋子，將反應(yīng)管插入帶孔的漂板內(nèi)，放入已經(jīng)升溫到61℃的水浴內(nèi)，準(zhǔn)確反應(yīng)60分鐘。

4. 結(jié)果判斷

61℃反應(yīng)60分鐘后，立刻取出反應(yīng)管，放于室溫。以一張白紙或白色泡沫盒為背景，通過反應(yīng)管溶液顏色的變化，即可判斷檢測結(jié)果。如果溶液為藍(lán)綠色，則說明有支原體污染；如果為紫紅色，則說明沒有支原體污染（如圖1）。

注：在61℃反應(yīng)的時間必須準(zhǔn)確計時，zui多不得超過5分鐘，以免出現(xiàn)假陽性。必須在反應(yīng)后2小時內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判斷，避免室溫下擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，影響結(jié)果判別。