如何測(cè)定高保真DNA聚合酶的保真度？

　　什么是聚合酶保真度？

　　DNA聚合酶的保真度是指準(zhǔn)確復(fù)制目的模板的結(jié)果。具體來(lái)說(shuō)，這涉及到多個(gè)步驟，包括讀取模板鏈，選擇正確的三磷酸核苷，并將此核苷酸插入3’引物末端的能力。為了區(qū)分正確和錯(cuò)誤的核苷酸，一些DNA聚合酶具有3’到5’核酸外切酶活性。這種“校正”活性可切除不正確摻入的單核苷酸，并將其替換成正確的核苷酸。高保真PCR使用摻入錯(cuò)誤率低且具有校正活性的DNA聚合酶，以保證目的DNA的忠實(shí)復(fù)制。

　　保真度在何時(shí)很重要？

　　在設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，你首先要考慮你的應(yīng)用是否需要高保真聚合酶。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果依賴于正確的DNA序列（如克隆或測(cè)序），那么你就要盡量減少錯(cuò)配核苷酸的摻入。而對(duì)于普通PCR或菌落PCR，確定擴(kuò)增子是否存在或質(zhì)粒上是否帶有插入片段，那高保真則大可不必。由于某些高保真聚合酶的強(qiáng)勁特性，一些研究人員在所有擴(kuò)增中都使用它們。

　　如何測(cè)定保真度？

　　廠家通過(guò)各種不同的方法來(lái)確定DNA聚合酶的保真度。ThomasKunkel曾介紹過(guò)一種方法，使用M13噬菌體的部分lacZα基因，通過(guò)宿主菌落顏色的變化來(lái)檢查DNA合成中的錯(cuò)誤。以Kunkel的分析為基礎(chǔ)，WayneBarnes則開發(fā)出一種分析，利用PCR來(lái)復(fù)制整個(gè)lacZ基因和兩個(gè)抗藥性基因的一部分，隨后連接、克隆、轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選。若lacZ基因存在錯(cuò)誤，則破壞β-半乳糖苷酶活性，導(dǎo)致白斑的出現(xiàn)。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)方法，白斑克隆的比例可轉(zhuǎn)化為錯(cuò)誤摻入的數(shù)量。Sanger測(cè)序則提供了保真度的更直接讀取，可檢測(cè)所有突變。利用這種方法可確定聚合酶的整個(gè)突變譜。

　　何為高保真？

　　關(guān)于DNA聚合酶的高保真，目前還沒(méi)有統(tǒng)一的定義。人們往往與TaqDNA聚合酶比較，來(lái)判斷保真度的相對(duì)高低。例如，NEB（New EnglandBiolabs）的科學(xué)家測(cè)定Taq聚合酶的錯(cuò)誤率為2.7x10-4 ±0.8x10-4，或每3700個(gè)堿基1個(gè)錯(cuò)誤。這些數(shù)據(jù)表明，利用Taq以25個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增400bp的片段，可能一半的克隆都帶有錯(cuò)誤。對(duì)于較大的片段如1kb，每個(gè)克隆都可能帶有不想要的突變。相比之下，NEB的Q5超保真聚合酶的錯(cuò)誤率比Taq低100倍。根據(jù)這一數(shù)據(jù)，200個(gè)克隆中的199個(gè)將是正確的。