CFDA, SE 細(xì)胞增殖示蹤熒光探針檢測(cè)原理與注意事項(xiàng)

CFDA-SE可用于細(xì)胞示蹤，也可用于細(xì)胞增殖檢測(cè)。經(jīng)CFDA-SE標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能。CFDA-SE常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測(cè)，也可用于成纖維細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，造血祖細(xì)胞等其他細(xì)胞的增殖檢測(cè)。

檢測(cè)原理

CFDA SE可以通過(guò)完好的細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶催化分解成CFSE。CFSE可以隨機(jī)地、不可逆地和細(xì)胞內(nèi)蛋白的賴(lài)氨酸殘基或其它氨基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，并標(biāo)記這些蛋白，CFDA-SE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光。CFDA-SE標(biāo)記的分裂細(xì)胞每分裂一次，子代細(xì)胞的熒光會(huì)減弱一半，分裂一次的細(xì)胞熒光強(qiáng)度減半(1/2)，分離兩次的細(xì)胞熒光強(qiáng)度再減半(1/4)，以此類(lèi)推，熒光強(qiáng)度按照1/2，1/4，1/8，1/16的規(guī)律逐漸遞減。

使用方法

1、保存液配制（5 mM）

   按需配制，如取DMSO 360 μL，溶解1 mg CFSE，超音波溶解，得到5 mM CFSE保存液,將其按40 μL體積分裝于避光的無(wú)菌凍存管中，-20℃可保存2個(gè)月。

2、工作液配制

   取 5mM 的CFSE稀釋液1μL，加入1mL10％FCS的PBS稀釋。

3、染色

   (1) 重懸細(xì)胞。用有5％ FCS的PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度一般為1x1x10^6/mL（體外實(shí)驗(yàn)）或1x1x10^7/mL（轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)）。

   (2) 染色。1mL DFSE工作液與1mL細(xì)胞懸液混合后37℃孵育5~10 min。期間輕輕混勻2次。

   (3) 終止染色。用完培養(yǎng)液洗滌3次并離心。一般在第2次洗滌后再孵育5 min后進(jìn)行第3次洗滌。冰冷的含10% 新生牛血清、RPMI-1640 medium（含L-谷氨酰胺）（貨號(hào)：AC01L064），輕輕混勻1 min（用手輕彈，切忌吹打），1500 r/min 離心5 min。

(4) 流式細(xì)胞儀在FL1通道檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

 ? 所有試劑在使用前均需解凍、混勻，混勻過(guò)程中盡量避免產(chǎn)生氣泡；CFDA SE溶劑在較低溫度下會(huì)凝固，請(qǐng)于20-25℃水浴片刻至全部融化后再使用。

 ? 試劑中含有熒光染料，保存或進(jìn)行標(biāo)記時(shí)盡量避光操作，以避免熒光淬滅問(wèn)題。

 ? 不同細(xì)胞的內(nèi)酯酶活性不同，因此染色效果具有差異性?？筛鶕?jù)細(xì)胞類(lèi)型及培養(yǎng)條件摸索最佳工作濃度。

 ? 若需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，請(qǐng)用醛類(lèi)固定劑如3.7%多聚甲醛于室溫固定15 min；之后若還需要進(jìn)行其他如抗體標(biāo)記，請(qǐng)用冰丙酮透化處理細(xì)胞10min。

 ? 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。