活性氧ROS檢測原理及檢測步驟

ROS也叫活性氧（reactive oxygen species）是細胞內(nèi)產(chǎn)生的一種具有氧化活性的化學物質(zhì)，包括過氧化氫、超氧陰離子等。ROS在正常生理條件下也會產(chǎn)生，但當其產(chǎn)生過多或清除不足時，會對細胞造成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細胞損傷和疾病發(fā)生。

檢測原理

用于檢測細胞內(nèi)ROS廣泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA（二氯熒光黃雙乙酸鹽）是一種可指示的探針，其本身不具有熒光，但可以自由穿過細胞膜。一旦進入細胞，它會被細胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無法穿過細胞膜，因此熒光探針會在細胞內(nèi)積聚。細胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備，在最大激發(fā)波長480nm和最大發(fā)射波長525nm下檢測熒光

檢測步驟

一、裝載探針

刺激時間較短（通常為2 h以內(nèi)）的細胞：先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。

刺激時間較長（通常為6 h以上）的細胞：先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

1、原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

2、收集細胞后裝載探針（適用于貼壁細胞和懸浮細胞）

二、檢測

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

注意事項

① 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。

② 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否

良好。

③ 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

④ 根據(jù)結(jié)果顯示的整體熒光強度的高低，可以適當調(diào)整DCFH-DA探針的稀釋倍數(shù)以及孵育時間。