雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒實驗原理與應(yīng)用方向（雙熒光素酶活動）

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— 實驗原理 —

螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61KD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光。

圖1.螢火蟲熒光素酶催化反應(yīng)原理

海腎熒光素酶是一種分子量約為36KD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的過程中也會發(fā)出生物熒光。

圖2.海腎熒光素酶催化反應(yīng)原理

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，螢火蟲熒光素酶作為報告基因反應(yīng)目的基因表達的改變，海腎螢光素酶作為內(nèi)參基因，提供轉(zhuǎn)錄效率的對照（減少內(nèi)在變化因素如培養(yǎng)細胞的數(shù)目，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率對實驗準(zhǔn)確性的影響）。兩種熒光素酶沒有種屬同源性并對應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而沒有交叉干擾。

— 應(yīng)用方向 —

一、靶基因驗證

miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結(jié)合位點突變型）序列構(gòu)建至載體中報告基因Luc的3’端，通過比較過表達miRNA后，報告基因表達的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），明確miRNA的作用及miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。

圖3.靶基因驗證實驗設(shè)計原理

相關(guān)實驗適用類型：miRNA-靶基因（mRNA、LncRNA、circRNA）、m6A位點、增強子

二、啟動子活性驗證

轉(zhuǎn)錄因子主要通過作用于靶基因的啟動子起作用，將目的基因啟動子區(qū)序列構(gòu)建在報告基因Luc的5’端，通過共表達轉(zhuǎn)錄因子后，根據(jù)報告基因表達的改變，來確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子結(jié)合位點及對靶基因的作用。

圖4.啟動子驗證實驗設(shè)計原理

— 應(yīng)用示例 —

1、示例一

文章標(biāo)題：METTL14/miR-29c-3p axis drives aerobic glycolysis to promote triple-negative breast cancer progression though TRIM9-mediated PKM2 ubiquitination

發(fā)表期刊：Journal of cellular and molecular medicine

和元助力：將WT TRIM9-3’UTR 和突變型 TRIM9-3‘UTR 構(gòu)建至pMIR-REPORT載體，通過共轉(zhuǎn)染miR-29c-3p mimics, miR-29c-3p inhibitor和 miRNA-NC，明確了miR-29c-3p與TRIM9的結(jié)合。

2、示例二

文章標(biāo)題：The ELAVL3/MYCN positive feedback loop provides a therapeutic target for neuroendocrine prostate cancer

發(fā)表期刊：Nature communications

和元助力：為了闡明MYCN轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制，作者分別將ELAVL3的全長以及Segments A, B, C的啟動子構(gòu)建到luciferase報告基因載體上。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，發(fā)現(xiàn)MYCN顯著上調(diào)full-length ELAVL3和ELAVL3 Segment A兩組的luciferase信號，證明了MYCN對 ELAVL3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

3、示例三

文章標(biāo)題：METTL3 facilitates stemness properties and tumorigenicity of cancer stem cells in hepatocellular carcinoma through the SOCS3/JAK2/STAT3 signaling pathway

發(fā)表期刊：Cancer gene therapy

和元助力：SOCS3的CDS區(qū)，包含m6A識別位點野生型（GGACU）以及突變型（CCTGA），被構(gòu)建在pMIR-REPORT載體上。通過過表達和干擾METTL3的表達，同時利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了METTL3和SOCS3的相互作用。

/ 雙熒光素酶活動 /

活動時間：即日起--6月28日

獎品（隨機抽取6位）：送1年的年卡，有愛奇藝、騰訊視頻、優(yōu)酷、芒果、嗶哩嗶哩 、音樂、網(wǎng)易云音樂-(可挑選其中1張)

活動范圍：全國生物相關(guān)終端客戶

kai獎時間：2024年6月28日13：00

領(lǐng)取方式：3個工作日內(nèi)聯(lián)系梁經(jīng)理兌獎，逾期視為自動放棄

注意事項:

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4、活動最終解釋權(quán)歸和元李記所有。