細(xì)胞凍存原理與方法（細(xì)胞凍存液選擇）

近年來，通過輸注免疫細(xì)胞或干細(xì)胞進行相關(guān)疾病的治療取得良好療效，細(xì)胞治療技術(shù)展示出越來越廣闊的臨床應(yīng)用前景。通常細(xì)胞從采集到臨床應(yīng)用會間隔很長時間，而新鮮細(xì)胞產(chǎn)品保存時限較短，為了延長細(xì)胞保存時限或長期保存細(xì)胞產(chǎn)品，需要對細(xì)胞進行冷凍后儲存。

細(xì)胞冷凍保存的原理

細(xì)胞凍存是通過冷凍保護機制將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，保持細(xì)胞活性，以便長期儲存的一種技術(shù)。細(xì)胞復(fù)蘇后，蛋白質(zhì)仍有活性，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能仍完好。

隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)晶，所形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞，特別是0~-20℃的階段，冰晶呈針狀，極易引發(fā)細(xì)胞損傷。在不加任何保護劑條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中形成的冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，引起細(xì)胞死亡。

如果在細(xì)胞溶液中加入冷凍保護劑，可保護細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑容易同水分子結(jié)合，降低冰點，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)形成冰晶前透出細(xì)胞，并且通過降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫（液氮）條件下保存。冷凍保護劑對細(xì)胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)，且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。

細(xì)胞冷凍保護劑

細(xì)胞冷凍保護劑可以根據(jù)否穿透細(xì)胞膜分為滲透性和非滲透性兩種。滲透性冷凍保護劑可以透過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)，多為小分子，包括二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇等，這類保護劑能夠在細(xì)胞冷凍懸液凝固之前，穿過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細(xì)胞損傷。DMSO是臨床級凍存保護劑中重要的成分，目前經(jīng)典的凍存保護劑中通常含有10%左右的DMSO。DMSO是常用的凍存保護劑和常用藥用輔料，在國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心藥用輔料數(shù)據(jù)庫可以查詢到其詳細(xì)信息。非滲透性冷凍保護劑一般是一些大分子物質(zhì)，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，主要包括右旋糖苷、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等，其可以優(yōu)先同溶液中的水分子相結(jié)合，使冰點降低，減少冰晶的形成。由于其分子量大，可以使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷，同時能降低溶液中低分子溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，減輕鹽損傷。

細(xì)胞冷凍保存的一般流程

細(xì)胞凍存過程要緩慢，復(fù)蘇則相反，應(yīng)快速升溫。慢凍的原因如上所述，為了避免降溫時，細(xì)胞內(nèi)的水分還未來得及脫離細(xì)胞，但卻形成冰晶，對細(xì)胞造成損傷。（1）凍存前觀察細(xì)胞狀態(tài)，測定細(xì)胞活率和計數(shù)。（2）將要凍存的細(xì)胞收集于離心管中，1200~1800rpm，離心5min，棄上清。（3）根據(jù)需要調(diào)整細(xì)胞凍存密度，緩慢加入適當(dāng)體積配制好預(yù)冷的凍存液或市售的無血清細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞。（4）將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，旋緊管蓋，做好標(biāo)記。（5）將凍存管放入程序降溫盒（預(yù)冷）內(nèi)，然后放至-80℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。

如何選擇細(xì)胞凍存液

細(xì)胞凍存液的質(zhì)量和成分對細(xì)胞的凍存效果有很大的影響。如果細(xì)胞凍存液的成分不合適或質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，可能會導(dǎo)致細(xì)胞凍存失敗或細(xì)胞復(fù)蘇后存活率低。

選擇細(xì)胞凍存液時，應(yīng)考慮以下3個重要因素：

（1）細(xì)胞類型，不同的細(xì)胞類型對細(xì)胞凍存液的成分和濃度有不同的要求。

（2）凍存時間，細(xì)胞凍存的時間越長，對細(xì)胞凍存液的要求越高。

（3）復(fù)蘇率，細(xì)胞凍存液的質(zhì)量和成分對細(xì)胞的復(fù)蘇率有很大的影響。

下面給你介紹下李記生物~李記生物細(xì)胞凍存液的主要產(chǎn)品：

• 藥輔級細(xì)胞凍存液（非程序降溫）

• 快速細(xì)胞凍存液（GMP級）

• 無血清細(xì)胞凍存液（無DMSO）

• 無血清細(xì)胞凍存液（增強型）

• 快速細(xì)胞凍存液（無血清、無蛋白）

一、快速細(xì)胞凍存液（無血清、無蛋白）

和元李記快速細(xì)胞凍存液（無血清、無蛋白）可適應(yīng)于絕大部分腫瘤細(xì)胞和常規(guī)細(xì)胞，大部分干細(xì)胞（和元李記已測試細(xì)胞種類請關(guān)注），凍存細(xì)胞可在 -80℃ 長期保存（＞6年）。不含動物源性蛋白，不含血清成分，可有效減少各類細(xì)菌、病毒和支原體等污染，保證凍存細(xì)胞的安全。該凍存液含DMSO、葡萄糖等各種細(xì)胞營養(yǎng)成分，提高細(xì)胞存活率和活力，亦適合于無血清培養(yǎng)細(xì)胞和蛋白表達(dá)細(xì)胞。

產(chǎn)品優(yōu)勢

1. 無需程序性降溫，可直接將細(xì)胞放入凍存液置于-80℃冰箱（-80℃可保存＞6年），凍存液無需稀釋。

2. 凍存液不含血清，大大降低細(xì)胞污染可能性。

3. 不要加血清，不要反復(fù)逐級降溫，不要液氮，綜合下來省時更省錢。

4. 案列可于-資源支持查詢！

5. 各細(xì)胞凍存數(shù)據(jù)，可參考下方李記凍存液數(shù)據(jù)庫（數(shù)據(jù)由使用客戶反饋）

產(chǎn)品組分

運輸與保存

常溫運輸。4℃保存，有效期24個月。

二、無血清細(xì)胞凍存液（無DMSO）

產(chǎn)品描述

李記生物無血清細(xì)胞凍存液（無DMSO）適用于多種細(xì)胞的冷凍保存，尤其適用于原代肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的凍存。

訂購信息

產(chǎn)品參數(shù)

運輸與保存

藍(lán)冰運輸。4℃密封保存，有效期12個月。

三、無血清細(xì)胞凍存液（增強型）

產(chǎn)品描述

李記生物無血清細(xì)胞凍存液（增強型）適用于常用動物細(xì)胞系的冷凍保存，尤其適用于原代細(xì)胞、干細(xì)胞等的冷凍保存。

訂購信息

產(chǎn)品參數(shù)

運輸與保存

藍(lán)冰運輸。4℃密封保存，有效期24個月。

四、快速細(xì)胞凍存液（GMP級）

產(chǎn)品描述

和元李記快速細(xì)胞凍存液（GMP級）不含動物源性蛋白，不含血清成分，可有效減少各類細(xì)菌、病毒和支原體等污染，保證凍存細(xì)胞的安全。通用于各種動物細(xì)胞株，尤其適用于各類原代細(xì)胞、干細(xì)胞及雜交瘤等蛋白表達(dá)細(xì)胞的凍存。

本產(chǎn)品含多種保護劑、穩(wěn)定劑組合，可顯著降低凍存過程中溶液冰點，提高細(xì)胞膜對水的通透性，有效防止冰晶對細(xì)胞的損傷；同時降低冰凍時細(xì)胞周圍電解質(zhì)濃度，避免電解質(zhì)損傷；還可延緩凍存過程中細(xì)胞的互相擠壓，保護細(xì)胞膜。從而極大提高細(xì)胞復(fù)蘇率和活力。

產(chǎn)品優(yōu)勢

1. 便捷：即用型，無需程序性降溫，可直接將細(xì)胞放入凍存液置于-80℃冰箱，也可在后續(xù)轉(zhuǎn)移至液氮中進行長期保存。

2. 高效：細(xì)胞存活率和復(fù)蘇活力高，普遍高于90% 。

3. 安全：無血清，無動物源成分，化學(xué)成分明確，大大降低細(xì)胞污染可能性。

4. 質(zhì)優(yōu)：嚴(yán)格的質(zhì)量控制，產(chǎn)品性能媲美進口；所有原料均選自經(jīng)嚴(yán)格檢測的低內(nèi)毒素、高純藥用級別原料，采用低DMSO配方，注射用水配置符合GMP生產(chǎn)。

5. 批間差異?。?/span>全程于GMP潔凈車間生產(chǎn)與包裝，并經(jīng)過嚴(yán)格的內(nèi)毒素、滲透壓、 PH、細(xì)菌病原體等質(zhì)量檢測，確保產(chǎn)品質(zhì)量及批次間的一致性。

6. 適用范圍廣：通用于各種動物細(xì)胞株，尤其適用于各類原代細(xì)胞、干細(xì)胞及雜交瘤等蛋白表達(dá)細(xì)胞的凍存；已通過實驗證明不不會影響干細(xì)胞表型和生長狀態(tài)，且可維持干細(xì)胞的多分化性。

7. 案列可于-資源支持查詢！

產(chǎn)品組分

運輸與保存

藍(lán)冰運輸。4℃保存，有效期12個月。

五、藥輔級細(xì)胞凍存液（非程序降溫）

產(chǎn)品描述

藥輔級細(xì)胞凍存液（非程序降溫）是由李記生物自主研發(fā)的含有7.5% DMSO，無血清、無動物成分的即用型細(xì)胞凍存液，在超低溫（-80℃～-196℃）環(huán)境下為細(xì)胞提供一個安全、有效的保護環(huán)境，凍存復(fù)蘇后細(xì)胞活率可達(dá)90%以上。

本產(chǎn)品含有甘氨酸，DMSO以及磷酸鹽緩沖液的水溶液，適用于間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存。

訂購信息

產(chǎn)品參數(shù)

運輸與保存

藍(lán)冰運輸。4℃密封保存，有效期24個月。

本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。