細胞凍存和細胞凍存步驟

　　細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而細胞凍存步驟及細胞凍存液的選擇也是影響細胞凍存效率及解凍復蘇后細胞活力的主要條件。
 

　　下面就以細胞凍存液為例講解細胞凍存原理及細胞凍存的步驟。
 

　　細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。
 

　　細胞凍存方法主要操作步驟為：
 

　　(1)選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收 集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。
 

　　(2)去上清液，加入含20%小牛血清的培養(yǎng)基，于4℃預冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL 之間。
 

　　(3)將上述細胞分裝于安瓿或專用冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記 好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記(日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù))。
 

　　(4)將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中 2～3小時，再移至冰箱冷凍室內3～4小時(此步可省略)，再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時，最后沉入液氮中。
 

　　細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，最好取出一只安瓿細胞復蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。