蛋白保存方法，你知道多少

　　生物大分子的貯藏保存可分為干態(tài)和液態(tài)貯藏兩種。蛋白質(zhì)失活受多種理化因素的影響，主要有空氣、溫度、水分、光線、酸堿度、樣品狀態(tài)、微生物活動、保存時間和容器等。這些因素可單獨起作用，但更多情況是協(xié)同作用?？偟膩碚f，蛋白質(zhì)的保存主要考慮其構(gòu)型穩(wěn)定、活性中心的保護(hù)、避免輔助因子喪失等，以防止其變性、解聚或降解。由于溫度和水分對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響很大，故蛋白質(zhì)最好是低溫、冷凍或冷凍干燥后低溫干燥保存。
 

　　1. 液態(tài)保存
 

　　(1).在低溫下保存 蛋白質(zhì)對熱敏感，溫度越高，穩(wěn)定性越差。因此，低溫保存蛋白質(zhì)溶液在絕大多數(shù)情況下是有利的。一般蛋白質(zhì)越純，其穩(wěn)定性越差。特別是純酶溶液，對熱很不穩(wěn)定(少數(shù)酶例外，如核糖酸酶能短期煮沸，胰蛋白酶能在稀HCl中耐90℃，及某些高溫細(xì)菌產(chǎn)生的耐熱性酶等)，多數(shù)在35℃一40℃以上就會失活，難以長期保存，在普通冰箱中通常也只能保存一周左右。因此，液態(tài)蛋白質(zhì)樣品常常在—5℃～—10℃以至—20℃以下冰凍保存比較理想，有時經(jīng)數(shù)月或數(shù)年仍保留大部分活性。
 

　　但是，各種蛋白質(zhì)的耐熱性不同，并非溫度越低.穩(wěn)定性越好。羧肽酶、脂蛋白和某些抗體經(jīng)冰凍再融解，即*變性破壞。但某些酶經(jīng)凍融后，活性反而增加，這可能是由于酶顆粒結(jié)構(gòu)松散，表面積增大，暴露出更多活性基團(tuán)的緣故。反復(fù)冰凍和融化一船會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性.應(yīng)盡量避免。為了防止凍融損傷，冰凍保存要求樣品濃度大、體積小、表面積大、含鹽低、凍結(jié)迅速、—70℃以下保存、用時迅速融化等。
 

　　(2).在穩(wěn)定PH下保存 多數(shù)蛋白質(zhì)只有在很狹窄的pH范圍內(nèi)才穩(wěn)定.超出此范圍即迅速變性。如鯨肌紅蛋白在等電點PH6.8附近時穩(wěn)定，卵類粘蛋白在中、酸性條件下對熱 穩(wěn)定。蛋白質(zhì)穩(wěn)定存在的PH一般是等電點。因此，酸性、中性和堿性蛋白酶酌穩(wěn)定pH分別為PH2～PH6、PH6～PH9和PH5～PH10.5。但也有例外，如血漿蛋白質(zhì)的等電點PH4.6，而其穩(wěn)定pH為6.8，穩(wěn)定PH與其等電點并不相同。酶的穩(wěn)定PH也并非是酶反應(yīng)的最適PH，二者有時可相差l至數(shù)個pH單位。所以保存液態(tài)蛋白質(zhì)樣品時，應(yīng)小心調(diào)到其穩(wěn)定PH范圍內(nèi)。
 

　　(3).在高濃度下保存 液態(tài)蛋白質(zhì)易受水化作用影響，保存時濃度不能太稀(如1毫克/毫升以下)，否則將可能引起亞基解離、表面變性或器壁吸咐。一般蛋白質(zhì)在濃溶液中比較穩(wěn)定，中間樣品的保存可采用濕法沉淀。需要保存酶溶液時，其蛋白質(zhì)濃度也應(yīng)大于1%。保存時間較長時，還需加入防腐劑、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)或其它穩(wěn)定劑。如免疫球蛋白可加 0.04%疊氮鈉，-20℃下凍存。蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)的選擇：中性蛋白酶常用EDTA，堿性蛋白酶用二異丙基氟磷酸(DFP)、苯甲基璜酰氟(PMSF)，酸性蛋白酶用十二烷基磺酸鈉(SDS)、N —溴琥珀酰亞胺。活性中心為絲氨酸的蛋白面加二異丙基氟磷酸，活性中心為巰基的蛋白酶加對*等。但某些抑制劑(如DFP、PMSF)不僅抑制蛋白酶，對其它酶可能也有抑制作用，使用時應(yīng)慎重。
 

　　(4).在保護(hù)劑存在下保存 很早就有人觀察到，在無菌條件下，室溫保存了四十五年的血液，血紅蛋白僅有少量改變，許多酶仍保留部分活性。另一方面，有些純酶濃即使冷卻也很不穩(wěn)定，保存期僅為幾小時或幾天。上述兩種現(xiàn)象的原因是血液中含有某些使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的因家，而純酶則缺乏這些穩(wěn)定因素。為了較長期保存蛋白質(zhì)溶液(特別是敏感的純酶 或稀蛋白溶液)，常常加入某些穩(wěn)定劑進(jìn)行保護(hù)。多數(shù)蛋白質(zhì)只有在疏水環(huán)境才能長期保存。加入某些物質(zhì)可以降低溶液的極性，避免蛋白質(zhì)變性失活。一些蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度(1mol/L~4mol/L或飽和鹽液)的極性環(huán)境下保持活性，中性鹽可穩(wěn)定這類蛋白質(zhì)。 一些蛋白質(zhì)表面或內(nèi)部含有半胱氨酸巰基，易被空氣中的氧緩慢氧化為次磺酸或二硫化物，使蛋白質(zhì)因電荷或(和)形狀發(fā)生改變而失活。保存時可加人巰基試劑，使蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)，并隔絕空氣(甚至真空或惰氣中)密閉保存。
 

　　2.固態(tài)保存
 

　　(1).制成干粉或結(jié)晶 固態(tài)蛋白質(zhì)比液態(tài)穩(wěn)定。一般蛋白質(zhì)含水量超過10%時，無論在室溫或低溫均容易失活；含水量若降低至5%時.在室溫或冰箱中均比較穩(wěn)定，但在37℃活性則明顯下降。低含水量對微生物和化學(xué)活性不利，一般認(rèn)為，微生物活性在含水量10%以下、化學(xué)活性在3%以下即被抑制。長期保存蛋白質(zhì)的最好辦法是把它們制成結(jié)晶或干粉(現(xiàn)多采用冷凍干燥)。
 

　　(2).制成水不溶酶 在多數(shù)情況下，酶經(jīng)固定化后，對酸、堿、蛋白酶、溫度等穩(wěn)定性提高，更易于保存。
 

　　(3).制成酶衍生物 這也能提高某些酶的穩(wěn)定性。 總的來說，蛋白質(zhì)的保存主要考慮其構(gòu)型穩(wěn)定、活性中心的保護(hù)、避免輔助因子喪失等，以防止其變性、解聚或降解。由于溫度和水分對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響很大，故蛋白質(zhì)最好是低溫、冷凍或冷凍干燥后低溫干燥保存。