細(xì)胞凍存液分類與選擇

　　細(xì)胞凍存是細(xì)胞生物學(xué)研究及藥物研發(fā)細(xì)胞實驗中需要經(jīng)常面對的常規(guī)操作。隨著細(xì)胞越來越嬌，人工越來越貴，各種細(xì)胞凍存液應(yīng)運而生，如何從名目繁多的細(xì)胞凍存液中選擇變成一個問題。本文從細(xì)胞凍存液分類，應(yīng)用場景，使用效果等多方面加以闡釋，希望能對如何選擇細(xì)胞凍存液有所助益。

一、細(xì)胞凍存液的分類

1. 從成分劃分

（1）滲透性和非滲透性

　　滲透性保護劑分子量小可滲透到細(xì)胞內(nèi)，如甘油、DMSO、乙二醇等，其在細(xì)胞冷凍存*凝固之前，滲入細(xì)胞內(nèi)，降低細(xì)胞內(nèi)外溶液中的電解質(zhì)濃度，阻止細(xì)胞內(nèi)水分外滲，避免細(xì)胞過分脫水皺縮，避免細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境冰晶的生成。
　　非滲透性保護劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，多為大分子物質(zhì)，如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白及羥、yi、ji淀粉(HES)等。這些大分子優(yōu)先同溶液中的水分子結(jié)合，降低了細(xì)胞外自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶形成；同時，由于分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，減輕了溶質(zhì)損傷。

　　DMSO是一類滲透性細(xì)胞凍存保護試劑的代表，這類試劑包括：甘油、DMSO、乙烯醇和乙酰胺等。從上述幾種物質(zhì)滲透進出細(xì)胞的速度及細(xì)胞凍存效果看，DMSO效果更好，所以常規(guī)的細(xì)胞凍存液大都含有DMSO。DMSO在細(xì)胞凍存中保護細(xì)胞的原理是快速降低細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)濃度、減少降溫通過冰點時冰晶產(chǎn)生進而保護細(xì)胞免受傷害。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液是使用培養(yǎng)基、血清和DMSO按照一定的比例混合，其中DMSO的含量是10%。

（２）是否含血清

　　細(xì)胞凍存液含血清是從細(xì)胞生長環(huán)境角度考慮對細(xì)胞進行保護，但含血清（屬動物源成分）勢必需要考慮細(xì)胞污染、批間穩(wěn)定性等因素，另外隨著細(xì)胞治療研究逐漸成為熱點，研究及生產(chǎn)過程的可預(yù)知、可控制要求，胎牛血清的使用液受到限制。包括李記生物在內(nèi)的多家公司陸續(xù)開發(fā)成功不含血清的細(xì)胞凍存液，不含血清及動物來源性蛋白，減少病毒、霉菌和支原體等的污染。含血清的細(xì)胞凍存液一般采用程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮），原因是血清中含有大量蛋白、細(xì)胞因子，血清含量較大的凍存細(xì)胞凍存液在溫度快速降低時，會造成有較多蛋白沉淀。

（３）是否含DMSO

　　作為滲透性細(xì)胞保護劑的代表，DMSO應(yīng)用非常廣泛，DMSO可以快速滲透進入細(xì)胞，是非程序性降溫的基礎(chǔ)。但是DMSO在低溫下能保護細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，研究結(jié)果表明，培養(yǎng)液中DMSO濃度為10 %時，細(xì)胞生長抑制率近100 %；1%濃度時抑制率為35%，即使是0.04 %的濃度，DMSO對細(xì)胞的生長也有不利的影響。正是因為如此，細(xì)胞復(fù)蘇后需要離心去除DMSO。在一些臨床研究中，如果在細(xì)胞凍存中用到了DMSO，則需要說明其對細(xì)胞的毒副作用是否對細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，也需要說明DMSO殘留的問題。DMSO替代物的開發(fā)也是從滲透與非滲透兩個方向研究，目前來看，滲透性的小分子化合物更具前景。李記生物從2015年開啟不含血清，不含DMSO的細(xì)胞凍存液產(chǎn)品的研發(fā)；第一代低DMSO得GMP級別凍存液已于2022年上市，詳情可關(guān)注李記生物微信公眾號文章-搜索“凍存液"。

2. 從操作過程劃分

　　是否需要程序降溫是細(xì)胞凍存中需要考慮的另一個因素。常規(guī)細(xì)胞凍存液采用培養(yǎng)基+血清+DMSO配置，一般需要采用程序降溫凍存細(xì)胞（先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘，然后移至-20℃冰箱30分鐘，再移至-80℃冰箱保存16-18個小時（或隔夜），最后才移至液氮罐中進行長期的儲存）。目前包括李記生物已經(jīng)有多款新型細(xì)胞凍存液上市，不需要程序降溫，一步深凍，無需照看，節(jié)約了實驗時間。

二、細(xì)胞凍存液選擇

　　細(xì)胞凍存液的選擇須遵循幾個原則：①細(xì)胞在凍存和溶解過程中的損傷減低到最小，細(xì)胞存活率高；②凍存細(xì)胞復(fù)溫后，其的細(xì)胞生物學(xué)特性無明顯影響；③細(xì)胞復(fù)溫后，低溫保護劑容易去除，成分清楚，對細(xì)胞、人體無毒副作用；④凍存保護劑可快速起效，減少操作步驟；⑤價格。

三、注意事項

1. 常規(guī)細(xì)胞凍存液配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）與DMSO按9:1配制。DMSO溶于培養(yǎng)基時，DMSO加入培養(yǎng)基將釋放大量熱量，所以細(xì)胞凍存液需提前配制，避免燙傷細(xì)胞。注意，不能直接在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加DMSO。

2. 選擇不含DMSO的細(xì)胞凍存液時，需確認(rèn)替代成分的物質(zhì)基礎(chǔ)，如果替代成分較DMSO潛在危害更大，則得不償失。

3. 選用不含DMSO的細(xì)胞凍存液，需確認(rèn)無細(xì)菌及細(xì)胞污染，要進行支原體檢測。