Pikogreen熒光染料使用方法

使用方法

1. PikoGreen工作液的配制

使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen是以100µL 200×的濃縮液形式保存于無水DMSO中的（共10管），實驗當(dāng)天，根據(jù)實驗需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準(zhǔn)備足夠的操作溶液以2ml檢測體系測定20個樣品，可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見光易降解，盡量在配好后幾小時內(nèi)使用。

2. 配制標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液

1) 用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1μg/mL dsDNA 。根據(jù)在1cm 光程長度的比色杯中A260nm時的吸光度確定DNA 濃度；相應(yīng)于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標(biāo)準(zhǔn)液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測定法在通常污染核酸制劑的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線性良好，但是，為了得到有效的對照處理，被用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線的dsDNA 溶液要用和實驗樣品相同的方式來處理，并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。

2) 制備從0.5ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復(fù)8 個點的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中。混合相同體積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對照,避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表1: 用1 x 1cm 比色杯時DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃度配制參考

3) 當(dāng)用微量檢測皿適配器時，PikoGreen 測定也可在較低的測定體積（50μL 到200μL）內(nèi)完成。產(chǎn)生從1ng/mL 到100ng/mL（見表2）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部經(jīng)?？梢则?qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表2：用微量檢測皿DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃配制參考

4) 孵育后用合適的熒光計測量樣品熒光值。Ex/Em=480nm/520nm，為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測時間一致。用熒光值zui大的樣品校正儀器。

5) 用檢測數(shù)據(jù)與DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 樣品分析

1) 用1 x TE 稀釋待測DNA 樣品至需要的體積（1x1cm 比色杯需1.0mL，微量檢測皿需25-100μL）。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被zui大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無法吸取的情況。

2) 在每個樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。

3) 檢測、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度?？梢詫悠愤M(jìn)行不同的稀釋處理重復(fù)測定以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。