細胞骨架的熒光探針標記方法

細胞骨架主要有微管(micmtuble, MT)，微絲(microfilament, MF)，中間絲(intermediate filament, IF三種類型。它們分別由不同的蛋白單體組裝而成，其中微管蛋白(tubulin)、肌動蛋白(actin)、波形蛋白(vimentin)等是細胞骨架的重要組成部分，也是zui常被研究的細胞骨架蛋白。

1963年.Slauterback采用戊二醛常溫固定方法.首先使用電鏡在水螅刺細胞中發(fā)現(xiàn)了微管。隨后，微絲和中間絲相繼被發(fā)現(xiàn)。它們廣泛存在于真核細胞中.細胞骨架蛋白的含量占細胞總蛋白含量的10％-30％。它們與細胞形態(tài)的維持，細胞器的空間定位及位置改變.細胞的運動。細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸，細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，免疫行為和細胞分裂等活動有密切的關(guān)系。

一、細胞骨架的熒光探針標記方法

1. 微管蛋白(tubuline)的標記

一般使用間接標記的方法，一抗為抗tubulin單抗，二抗為抗小鼠IgG的熒光抗體，就可以展現(xiàn)出固定細胞，冰凍切片的微管結(jié)構(gòu)。這種小鼠來源的單抗識別微管N端結(jié)構(gòu)域的第69-97個氨基酸殘基。同時也是用于ELISA和Western blotting的抗體。檢測微管的其他探針有：Bis-ANS是離體狀態(tài)下微管裝配的強抑制劑，熒光探針與蛋白的疏水裂隙結(jié)合，且結(jié)合后熒光強度增強。用于檢測微管蛋白時間和溫度依賴性的解聚。DCVJ(4-(dicyanovinyl) julolidine) 用于活細胞微管蛋白裝配動態(tài)過程的探針。它的作用可被細胞松弛素D(cytochalasin D) 所阻斷。

2. 微絲的標記

用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)標記。鬼筆環(huán)肽是從一種菌類Amanita Dhalloides所提取出來的環(huán)肽。它與F—actin競爭性的結(jié)合。熒光標記的鬼筆環(huán)肽在納克水平就可與F-actin選擇性的結(jié)合并且易溶于水.為檢測組織切片.培養(yǎng)細胞和無細胞體系中的actin的定位和定量提供了非常方便的標記方法。在肌細胞和其他細胞中鬼筆環(huán)肽與actin亞單位一比一結(jié)合。并且不與G-actin結(jié)合。鬼筆環(huán)肽比actin的抗體標記有*性。首先，在不同種類生物中它的結(jié)合性質(zhì)不發(fā)生改變。其次.鬼筆環(huán)肽標記的非特異性信號可忽略.因而圖像的反差較好。

3. 其他細胞骨架蛋白的標記

抗波形蛋白(vimentin)抗體。抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體，抗結(jié)蛋白抗體(Anti-Desmin Antibody)等。

二、細胞骨架的共聚焦研究技術(shù)

1. 激光共聚焦顯微鏡的工作原理

激光共聚焦顯微鏡選用單色性好，單向性好的激光作為光源。激光通過一個照明針孔到達樣品，樣品只被一個具有精密幾何形狀的光點照射在焦平面上，只有被照射到的特定點所發(fā)射的熒光通過探測針孔到達檢測器.該點以外的任何發(fā)射熒光均被該針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的.這就是激光掃描共焦顯微鏡系統(tǒng)中共焦的真正含義。激光共聚焦顯微鏡利用光電倍增管采集和放大信號。計算機以像點的方式將成像點顯示在屏幕上，由光路中的掃描系統(tǒng)在整個樣品上掃描.在顯示器上產(chǎn)生一幅完整圖像。這幅圖像即為焦平面的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動.將樣品新的一個層面移到共焦面上.樣品的這個新層面又成像在顯示器上。隨著Z軸的不斷移動.就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。我們將從共聚焦顯微鏡系統(tǒng)獲得的連續(xù)光切圖像比喻為顯微CT，從這些連續(xù)的光切圖像可通過三維重組模擬出樣品真實的立體結(jié)構(gòu)。共聚焦顯微鏡憑借其*的成像原理大大提高了分辨率，它在X-Y平面的橫向分辨率比普通的顯微鏡要高出約40％，而且它還可以對厚樣本進行非介入無損傷性連續(xù)光學(xué)切片，得到三維重組的空間立體圖像。近十年來，人們已廣泛應(yīng)用CLSM來觀察和分析細胞內(nèi)的微細結(jié)構(gòu)和分子在細胞內(nèi)的分布，觀察細胞內(nèi)離子，蛋白分子的變化，包括細胞內(nèi)鈣，活性氧，轉(zhuǎn)錄因子，表面分子，細胞凋亡，細胞膜流動性，細胞內(nèi)分子的運動.細胞間的縫隙連接，蛋白間的相互作用等。共聚焦的分析研究已經(jīng)涉及了生物學(xué)的幾乎所有領(lǐng)域。

2. 激光共聚焦的圖像采集和圖像處理與數(shù)據(jù)分析方法

將制備好的細胞放在熒光顯微鏡的載物臺上進行觀察找到需采集的視野，將熒光顯微鏡轉(zhuǎn)到掃描的位置。根據(jù)樣品的實際情況.在控制軟件的界面中選擇圖像采集的參數(shù)，包括激發(fā)光的波長，發(fā)射光的范圍，掃描模式，掃描速度，探測針孔，電子放大倍數(shù)等參數(shù)。啟動預(yù)掃，并調(diào)節(jié)光電倍增管的電壓PMT，Z軸的位置等，調(diào)節(jié)屏幕的圖像的細節(jié)清晰銳利，然后采集圖像。還可設(shè)定z軸的一定范圍。按照設(shè)定的步距進行光學(xué)切片。采集得到的圖像還可以通過圖像處理和數(shù)據(jù)分析得到所需要的數(shù)據(jù)和圖像。三維光切的圖像可以顯示為假三維的疊加圖.還可以用軟件實現(xiàn)三維重組得到細胞和組織的空間圖像。

3．卵細胞紡錘體的激光共焦研究技術(shù)

以下就以家兔卵細胞的紡錘體的共焦研究為例來說明細胞骨架共焦研究技術(shù)和方法。

1）MII期卵母細胞紡錘體的熒光染色：卵母細胞經(jīng)以下步驟處理

a. 固定及透化液(2％甲醛+0.1％Triton X-100+1μg／ml taxol)，30min。

b. PBS 3次，每次15min。

c. 封閉劑(PBS+2％BSA+2％正常羊血清+2％脫脂奶+0.01％Triton X-100+0.02％疊氮鈉+0.1mol/L甘氨酸)4℃隔一晚。

d. 鼠微管蛋白單克隆抗體(mouse monoclonal anti-a-tubulin)孵育30—60min。

e. 封閉液沖洗3次，15-20min／次。

f.  FITC標記的羊抗鼠IgG孵育30min， PBS洗3次。

g. 加入PI(碘化丙啶)0.5μg/ml, 10min，PBS洗2次。

所有步驟均在37℃下進行。標本使用LEICA LCSSP2 Laser Scanning Confocal Microscope LCS軟件采集和處理圖像。

2) 圖像采集的儀器條件

物鏡采用HCX PL APO CS 63／1.32 OIL UV。雙通道采集信號，*通道激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為515-535nm。第二通道激發(fā)波長為543nm，發(fā)射波長為590-630nm。采集模式為xyz，Pinhole為1.60，z軸的總厚度為10.36mm，Z軸以1.4mm為步距連續(xù)光切。

三、激光共焦顯微鏡在細胞骨架研究中的優(yōu)勢

1. 分辨率高.激光共焦顯微鏡比傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率高1.4倍。對于觀察細胞骨架等微細結(jié)構(gòu)比傳統(tǒng)熒光顯微鏡*。共焦顯微鏡只采集到樣品焦平面的像.使細胞骨架的像更加清晰。

2. 激光共焦顯微鏡實現(xiàn)了對樣品的不同層面進行掃描從而產(chǎn)生不同層面的共焦圖像。細胞骨架和細胞骨架所形成的一些結(jié)構(gòu)。如紡錘體都具有一定的空間分布.利用激光共焦顯微鏡可以對這些結(jié)構(gòu)進行無損傷的連續(xù)三維光切，形成他們的疊加圖像.或經(jīng)過共焦的圖像處理，三維重組得到他們的立體圖像。這一點是其他的檢測方法所無法做到的。

3. 與電鏡相比，標本制備要簡便的多，既省時又省力。還可以避免標本制備過程中的假陽性。

綜上所述.激光共焦顯微鏡因為其*的成像原理決定了它在細胞骨架研究中的重要地位。這項技術(shù)的發(fā)展為人類更好的認識和研究細胞骨架的功能及其與疾病的關(guān)系提供了很好的研究手段。